سیستم نورتابی الکتروشیمایی براساس نانو صفحات کربن نیترید گرافیتی در حضور شبکه های فلز-آلی جهت اندازه گیری متیلاسیون DNA در ژن های خاموش کننده سرطان (RASSF۱A) در پلاسمای افراد مشکوک

چکیده طرح

متیلاسیون DNA ، اضافه شدن گروه‌های متیل به آدنین و سیتوزین در توالی DNA ، یک فرایند تغییر اپی‌ژنتیک در توالی DNA می‌باشد که نقش بسیار مهمی در تنظیم بیان ژن و رونویسی، تمایز سلولی، و نیز پیشرفت سرطان دارد. از آنجایی که تشخیص متیلاسیون DNA در تشخیص اولیه سرطان و نیز مکانیسم سرطان‌زایی بسیار حایز اهمیت می‌باشد، بنابراین، تلاش‌های زیادی در جهت تعیین و تشخیص میتیلاسیون DNA صورت گرفته است (Krejcova, Richtera, Hynek, Labuda, & Adam, 2017).روش‌های مرسوم در تعیین متیلاسیون، از نظر هزینه مقرون به صرفه نمی‌باشد و زمان زیادی صرف آنالیزمی‌شود و نیازمند افراد متخصص در این زمینه می‌باشد. به همین دلیل به منظور سرعت بخشیدن برای تشخیص متیلاسیون DNA ، توسعه روش‌های کم‌هزینه، سریع، ساده، و نیز آسان برای تشخیص روش-های مراقبت در محل ضروری می‌باشد. متداولترین روش تشخیص متیلاسیون، واکنش زنجیره ای پلیمراز بهمراه ژل الکتروفور (Herman, Graff, Myöhänen, Nelkin, & Baylin, 1996)، بسط پرایمر تک نوکلئوتیدی (Feng, Wang, Han, & Wang, 2008)، طیف‌سنجی جرمی (Coolen, Statham, Gardiner-Garden, & Clark, 2007)، و نیز آنالیز بیسولفیت (Frommer et al., 1992)می‌باشد. با وجود این، این روش‌ها، از نظر هزینه مقرون به صرفه نمی‌باشد و زمان زیادی صرف آنالیزمی‌شود و نیازمند افراد متخصص در این زمینه می‌باشد. به همین دلیل به منظور سرعت بخشیدن برای تشخیص متیلاسیون DNA ، توسعه روش‌های کم‌هزینه، سریع، ساده، و نیز آسان برای تشخیص روش‌های مراقبت در محل ضروری می‌باشد. روش‌های الکتروشیمیایی، بواسطه مزیت‌هایی از قبیل حساسیت بالا و نیز قابلیت کوچک‌سازی در تشخیص و نیز تعیین متیلاسیون DNA بسیار مورد توجه قرار گرفته است (Daneshpour, moradi, Izadi, & Omidfar, 2016; F. Gao et al., 2018; Kurita, Yanagisawa, Kamata, Kato, & Niwa, 2017).تشخیص این روش‌ها، به سه دسته کلی تقسیم بندی می‌شوند. 1) تشخیص الکتروشیمیایی مستقیم بازهای سیتوزین میتلاسیون DNA (Kato et al., 2008; P. Wang, Mai, Dai, & Zou, 2010)، ۲) استفاده از مولکول‌های فعال الکتروشیمیایی نظیر کمپلکس‌های اسمیم در ساختار هیبرید اسیون DNA (Tanaka, Tainaka, Kamei, & Okamoto, 2007; Tanaka, Tainaka, Umemoto, Nomura, & Okamoto, 2007)، ۳) استفاده از آنزیم‌های محدود کننده حساس به نقاط سیتوزین متیله شده (S. Liu, Wu, Li, Zhang, & Cai, 2011)، و 4) استفاده از مولکول‌های فعال الکتروشیمیایی نظیر متیلن بلو (Dai, Hu, Wu, & Zou, 2012)و نیز طلا (Daneshpour et al., 2016).اگرچه این روش‌ها برای تشخیص حساس متیلاسیون DNA بسیار مناسب می‌باشد، اما این اندازه‌گیری‌ها نیازمند دستگاه-هایی می‌باشد که بتواند آنالیز داده‌ها به کمک روش‌های کامپیوتری به داده‌های قابل رویت تبدیل کند. بنابراین، استفاده از این سیستم‌ها بویژه در مناطق محدود با مشکلاتی همراه است. بعلاوه، این استراتژی‌ها دارای محدودیت‌هایی می‌باشد که عبارتند از، بالا بودن پتانسیل اکسیداسیون سیتوزین متیله شده و امکان همپوشانی با پتانسیل اکسیداسیون گروهای تیمین در توالی DNA که باعث می‌شود حساسیت و نیز انتخاب-پذیری روش پایین بیاید (M. Wang, Xu, Chen, Yin, & Ai, 2012).همچنین، اصلاح کمپلکس‌های اسمیم جهت اتصال به سیتوزین‌های متیله شده در توالی DNA پیچیده و زمانبر می‌باشد (Kurita, Arai, Nakamoto, Kato, & Niwa, 2012).علاوه بر این، از آنجایی که آنزیم‌ها به شرایط محیطی و نیز دمایی بسیار حساس می‌باشند، باعث ایجاد محدودیت‌هایی در استفاده از آنزیم‌ها در تعیین و تشخیص متیلاسیون می‌شود. از دیگر روش‌های تشخیص متیلاسیون DNA نیز می‌توان به روش‌های نورتابی الکتروشیمیایی اشاره کرد (Kurita et al., 2012; Li, Huang, Zheng, & Qi, 2012; Zhang et al., 2014; Zhao, Liang, Wang, & Qiu, 2015).در روش‌های نورتابی الکتروشیمیایی نور حاصل از گونه‌های برانگیخته شده توسط پتانسیل در سطح الکترود به عنوان جریان تجزیه‌ای مورد بررسی قرار می‌گیرد. بنابراین، این روش را می‌توان ترکیبی از روش الکتروشیمیایی و طیف‌سنجی دانست. از مزیت‌های این روش نسبت به روش‌های نوری می‌توان به موارد زیر اشاره کرد (W. Gao, Saqib, Qi, Zhang, & Xu, 2017).

1) اولین و مهمترین مزیت این است که آن نیازی به منبع نور ندارد که نه تنها باعث ساده تر شدن روش تشخیص بلکه مزاحمت‌های حاصل از نور پراکنده شدن توسط ناخالصی‌ها و همچنین لومینسانس آن‌ها را ندارد که باعث می‌شود حساسیت روش بالا برود.

۲) انتخاب پذیری ECL را می‌توان با استفاده از تغییر پتانسیل کنترل کرد و بدین ترتیب در حضور گونه‌های الکترو فعال دیگر نیز بتوان اندازه گیری را انجام داد.

در کار حاضر قصد بر این است که بتوان بر پایه نورتابی الکتروشیمیایی (ECL) ، و با استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال سیتوزین متیلاسیون، به تشخیص و تعیین سیتوزین متیله شده در ژن RASSF1A پرداخت. برای تشخیص سیتوزین متیله شده در توالی RASSF1A، ابتدا نانوذرات مغناطیسی توسط پروب این ژن که مکمل ژن هدف می‌باشد اصلاح شده، و پس از هیبرید شدن با توالی مورد نظر، در معرض آنتی‌بادی‌های قرار گرفته در سطح شبکه‌های فلز- آلی اصلاح شده با صفحات کربن نیترید قرار می‌گیرد. پس از اتصال سیتوزین متیله شده با آنتی‌بادی‌های قرار گرفته در سطح شبکه‌های فلز- آلی اصلاح شده با صفحات کربن نیترید، با در نظر گرفتن خاصیت مغناطیسی نانوذرات با استفاده از آهن ربا جداسازی انجام می شود. با قرار دادن در سطح الکترود اصلاح شده، تغییرات نورتابی الکتروشیمیایی صفحات کربن نیترید قرار گرفته در داخل شبکه های فلز-آلی را می توان به میزان DNA میتله در نمونه سرم خون نسبت داد و اندازه گیری کمی انجام داد

اهداف

تشخیص سریع متیلاسیون در پلاسما یا خون کامل بدون نیاز به PCR

دستیابی به یک سیستم اندازه‌گیری ساده و ارزان‌و بدون نیاز به هیچ دستگاههای پیچیده جهت شناسایی و تشخیص متیلاسیون DNA. در خون کامل یا پلاسما

شرح طرح و دستاوردها به زبان مردمی

هدف از انجام این تحقیق، سنتز نانوذرات مغناطیسی اکسیدآهن و عامل دار کردن سطح آن‌ها بوسیله‌ی گروه‌های کربوکسیل به منظور اتصال توالی پروب آمین دار موردنظر است. خاصیت مغناطیسی این ذرات اساس جداسازی در این روش است که امکان یک جداسازی سریع، ساده و کارآمد را به کمک اعمال یک میدان مغناطیسی فراهم می‌کند. علاوه بر این‌ها، به علت خاصیت مغناطیسی بالای Fe3O4، به راحتی از محیط پیچیده با استفاده از آهنربای مغناطیسی جدا می ¬ شوند که در نتیجه‌ی آن، کاهش مزاحمت‌های زمینه را به همراه دارد. بنابراین به بهتر شدن حد تشخیص و بالا رفتن حساسیت منجر می‌شود. در ادامه نانوصفحات کربن نیترید سنتز شده و پس از جداکردن این صفحات از یکدیگر، در حضور پیش ماده‌های شبکه‌های فلز-آلی ( MOF ) قرار خواهد گرفت. در این سنتز سعی بر این هست که نانوصفحات کربن نیترید به‌عنوان هسته باشند و MOF بصورت لایه اطراف این نانوصفحات را بگیرد (C3N4@MOF)